Проф. д.м.н. Радка Аргирова, вирусолог, Аджъбадем Сити Клиник ДКЦ и Токуда Болница, София
Преди да опишем особеностите в специфичната диагностика на HIV-инфекцията, ще дефинираме някои основни понятия от областта HIV/СПИН. HIV-инфекцията се определя като периодът от момента на заразяване с HIV до смъртта при естествен ход на инфекцията. СПИН е последната фаза на HIV инфекцията, като съществуват ясно определени критерии – клинични и лабораторни - за поставяне на диагнозата СПИН. Симптомите на остра/ хронична HIV инфекция при възрастни и деца са описани в Приложение 1 към чл.10,т.1 на Наредба N 47 на МЗ, обнародвана в ДВ, бр.103/29.12.2009 г. В Приложение 2 към чл.10,т.2 на същата Наредба са описани индикаторните заболявания за СПИН.
Прозоречен период е времето между заразяването с HIV и появата в кръвта на биохимично измерими маркери на инфекцията (най-често антитела, но като маркери могат да бъдат използвани и вирусспецифични антигени, както и вирусна РНК). Сероконверсия е моментът, в който се откриват биохимично измеримите маркери (най-често антитела към HIV, които най-вероятно се формират по-рано, отколкото се откриват). Практически, прозоречният период е времето между заразяването и откриването на антивирусните антитела. HIV антителата се откриват най-рано 2 седмици след заразяването, в 60-65% от случаите се откриват след 4 седмици, в 80% - след 6 седмици, в 90% - след 8 седмици и в 95-98% - след 12 седмици. При съвременните тестове от 4-то поколение освен анти-р24 антителата, се открива и р24 антигена – около 4-5 дни преди появата на антителата. Най-ранно определимият лабораторен маркер е HIV РНК, която пък се открива около 6-7 дни преди р24 антигена. Следователно, няма никакъв смисъл да се търсят специфични маркери на HIV преди началото на втората седмица след заразяването.
Специфичните диагностични методи при HIV-инфекция включват:
- Съвременни методи за доказване на HIV-инфекцията и.
- Съвременни методи за мониторирането и.
Диагностицирането на HIV инфекцията се базира на лабораторен скринингов тест. Най-често това е ELISA или хемилуминисцентен тест. Двукратно реактивен резултат от тези тестове трябва да бъде подложен на потвърдително изследване на същия серум (плазма) с теста Western blot.
Скриниращият тест обикновено е с висока чувствителност – т.е. не пропуска инфекция. Такива са използваните днес тестове 4-то поколение, определящи едновременно както антитела към HIV, така и циркулиращ вирус (вирусен антиген). Голямото им предимство е, че те силно скъсяват прозоречния период, тъй като могат да определят и вирусни антигени, ако антивирусните антитела все още не са се образували. Скриниращите тестове имат специфичност 99,0 – 99,5%. Това означава, че при специфичност напр. 99,5% една от 200 отрицателни проби ще покаже положителен резултат, който всъщност е фалшиво-положителен. Това именно се наблюдава в страни с ниско разпространение на инфекцията (както е у нас), за които потвърдителният тест е задължителен. Фалшиво-положителните резултати най-често са резултат от стимулиране на имунната система от различни фактори (бременност, автоимунни заболявания, други вирусни инфекции, понякога неотдавнашни ваксинации, хемодиализа и др).
Лицензираните скриниращи тестове „познават“ всички известни до днес на науката типове и субтипове на HIV-1 и HIV-2.
Определяните антитела са от типа IgG и скриниращите тестове не ги различават поотделно, т.е. отчитат се общо антивирусните антитела и/или антигени.
Днес все по-често се използват и т.нар. „бързи“ тестове за HIV. Практически те съответстват на скрининговите тестове, но резултатът от тях излиза много бързо (10-15 мин.), изпълняват се с капилярна кръв (убождане на пръста) и са особено полезни при спешни случаи. За потвърждение на „реактивните“ резултати от скрининговите тестове най-често се използва методът Western blot. Формулирани са и критериите за трите възможни резултата от Western blot (WB): позитивен, негативен и неопределен профил. Типичният позитивен профил изисква наличие на антитела срещу всички вирусни белтъци или поне на две антитела, едното от които задължително е срещу някой от гликопротеините (gp120/gp160, gp41) . Последният профил се наблюдава най-често при неотдавнашна инфекция, когато сероконверсията вече е налице, но е непълна. Негативният профил говори за липса на антитела срещу вирусните антигени – т.е. в серума (плазмата) на изследваното лице не се откриват антитела към HIV към момента на вземането на кръвта. При неопределения WB се наблюдават антитела, но в нетипична комбинация – липсват тези срещу гликопротеините, поради което не може да се приеме положителен резултат . Неопределеният WB не трябва да се тълкува като несигурен лабораторен резултат, а като находка, изискваща допълнително наблюдение и изследване. В този смисъл неопределеният профил не е окончателен резултат.
Съвременни методи за измерване на вирусния товар. PCR като допълнителен метод за потвърдителна диагностика и за мониториране на HIV инфекцията. Вирусният товар (Viral Load – VL) е параметър, включен днес в рутинното лабораторно мониториране на HIV инфекцията, независимо дали болният е на терапия или тя му предстои. Вирусният товар заедно с броя на CD4+клетките са най-важните маркери на развиващата се инфекция. Вирусният товар дава информация доколко висок е рискът от прогресиране на инфекцията, както и доколко терапията е успешна, ако вече се прилага.Индиректно този параметър подсказва и за настъпване на резистентност към някой от препаратите, влизащи в протокола на антиретровирусната терапия /ART/. Вирусният товар измерва количеството на вирусния генетичен материал HIV РНК, която директно корелира с броя на вирионите. Параметърът се изразява в копия/мл (напр. 100 000 копия HIV РНК/ мл) или в логаритъм с основа 10 (напр. в дадения пример log10 = 5,0). Параметърът „вирусен товар“ при HIV инфекцията измерва директно виремията и е тясно свързан с броя на CD4+ клетките, определящи функционалното състояние на имунната система на заразения индивид.
Напоследък, все по-често в практиката PCR се използва като потвърдителна диагностика, още преди провеждането на WB. Според нови препоръки на CDC , PCR анализът може да се използва за потвърждаване на „реактивен“ резултат след скриниращия тест вместо WB при определени условия. Това се обуславя от високата - 100% чувствителност на този тест и от по-ранното му позитивиране - често преди WB, практически в края на 1-та седмица след заразяването. При използване на 4-то поколение скринингов тест /както е в много лаборатории у нас/ реактивният резултат , обусловен от открития вирусен антиген/и може да се открие чрез PCR още преди формирането на антителата, т.е. по време на прозоречния период, преди настъпване на сероконверсията. В този случай PCR тестът ще се позитивира. Възможен е обаче и т.нар. втори фалшиво отрицателен диагностичен прозоречен период – такъв ще настъпи ако нивата на p24 антигена и anti-p24 антителата се изравнят. Най-добрата диагностика на острата HIV-инфекция се базира на откриване на вирусна репликация – позитивен PCR при отсъствие на антивирусни антитела – т.е. в условията на пре-сероконверсия.В практиката това се наблюдава при «неопределен» WB. Именно в този случай най-чувствителният тест е PCR, откриващ HIV-1 РНК.
Но PCR тестът се счита „позитивен“ само ако вирусният товар е над 1000 копия/мл /според някои автори – над 2000 копия/мл/. Известно е, че във фазата на острата HIV инфекция вирусния товар е от порядъка на милиони копия вирусна РНК/мл. Ако вирусният товар е под 1000 – 2000 копия/мл, PCR тестът се счита „негативен“ и WB e абсолютно задължителен за изключване на инфекцията. Не се препоръчва HIV PCR тестът да се използва като скринингов , включително и поради факта, че са възможни фалшиво отрицателни резултати. Следователно, серологичният скринингов тест не може и не бива да бъде подценяван и изместван.
Ето някои причини за фалшиво отрицателен PCR резултат:
1. Търговските HIV PCR тестове обикновено не откриват HIV-2 /рядко срещащ се в Европа/, необходимо е допълнително провеждане на HIV-2 PCR. В същото време, както вече казахме, скрининговите тестове от 4-то поколение откриват всички известни досега субтипове на HIV-1 и HIV-2.
2. По-малко от 1% от пациентите, заразени с HIV, могат да потискат вирусната репликация без лечение с антиретровирусна терапия - ART (“елитни контроли”). При такива пациенти PCR тестът ще е „отрицателен“, но скрининговите тестове и WB ще докажат инфекцията.
3. Както е известно, целта на антиретровирусната терапия е да редуцира вирусния товар до неопределимо ниво. Лица след терапия ще покажат „отрицателен“ PCR, но тестът WB ще остане винаги „позитивен“.
Скъсяването на прозоречния период при използване на скрининговите тестове от 4-то поколение, както и възприетото започване на антиретровирусната терапия веднага след диагностициране на инфекцията, ще налага все по-честото използване на PCR теста за доказване на инфекцията преди настъпването на сероконверсията. Редно е използването на PCR теста преди настъпила сероконверсия /най-често при неопределен WB , но „реактивен“ резултат в скрининговите тестове от 4-то поколение/ да бъде регламентирано и внедрено рутинно в потвърдителната диагностика.
Брой на CD4+клетките (хелперните клетки). Измерването им става обикновено чрез флоуцитометричен анализ с помощта на моноклонални антитела. Техният брой говори за функционалното състояние на заразения пациент, като определя и индивидуалния риск от прогресиране на инфекцията. Всеки индивид, живеещ с HIV, трябва да има брой на CD4+ клетки на 6-месечен интервал. Наблюденията показват, че достигането на 200 кл./микрол значително повишава риска от прогресия към СПИН, като под 100 кл./микрол практически са налице СПИН-индикаторни заболявания и/или опортюнистични инфекции.
В заключение, най-важната стъпка при диагностицирането на HIV инфекцията е да се мисли за нея. Хипотезата за HIV инфекция вече води до скринингов тест, при определени условия – и до PCR тест, определящ HIV РНК.
